Analises convencionais
Os métodos convencionais frequentemente usados para enumeração de coliformes são os de contagem em placas, tubos múltiplos e de membrana filtrante. Onde os dois primeiros são métodos trabalhosos, exigindo grande quantidade de meios de cultura e vidrarias. A técnica de filtração em membrana utiliza equipamento de custo elevado e não é indicado para águas com alto índices de turbidez ou muito poluidas, pois dificulta o processo de filtração.
TÉCNICA DE CONTAGEM EM PLACAS
A contagem de microrganismos em placas de petri com meios de cultura é um dos métodos mais utilizados em laboratórios, e ajuda a determinar o verdadeiro tamanho de uma população de bactérias. A principal vantagem de utilizar essa técnica está na possibilidade de quantificar a exata quantidade de células vivas presentes.
Por outro lado, a contagem de microrganismos em placas apresenta a desvantagem do tempo de incubação, já que são necessárias 24 horas para que as colônias visíveis apareçam de maneira clara nas placas utilizadas. Esse período é considerado relativamente longo, impedindo que a técnica seja utilizada em áreas que demandam maior agilidade.
É muito comum que a contagem de microrganismos em placa considere que cada colônia tem sua origem de crescimento e desenvolvimento em uma bactéria, porém, nem sempre isso é uma verdade, já que geralmente as bactérias tendem a crescer em cadeias ou em grumos. Por isso, a contagem em placas acaba sendo realizada nas unidades formadoras de colônias, também conhecidas como UFC.
Alguns cuidados devem ser considerados na hora de realizar a contagem de microrganismos em placas. Um passo essencial é garantir que apenas um número extremamente limitado de colônias possa crescer e se desenvolver em cada placa utilizada. O excesso de colônias em uma placa pode causar saturação, o que impede que outras colônias cresçam e se desenvolvam da melhor maneira possível. Como consequência, a contagem dos microrganismos acaba dificultada, o que pode prejudicar os resultados.
Ao optar pela contagem de microrganismos em placas, portanto, é importante que se utilize um método de diluição seriada. Dessa forma, é possível garantir que a quantidade de colônias que vão crescer na placa permanecerá exatamente na faixa desejada.
TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLOS
É uma técnica de análise quantitativa que permite conhecer o Número Mais Provável de microrganismos presentes na amostra original. Em tubos de ensaios são colocados os meios e alíquotas de amostras das diversas diluições. Após o período de incubação os tubos são especificados como positivo ou negativo. Com a ajuda da tabela do Número Mais Provável é possível identificar aproximadamente quantos dos microrganismos que foram analisados se fazem presentes na amostra.
No teste presuntivo para coliformes é utilizado o meio de cultivo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), é um meio de enriquecimento seletivo, para esses microrganismos, recuperando as células injuriadas. No qual é observado crescimento com produção de gás nos tubos de Durhan, indicando positividade. Para confirmação de coliformes totais é usado o Caldo Verde Brilhante Bile, que apresenta em sua composição sais biliares, que inibem o crescimento de microrganismos Gram positivos, e a lactose, utilizada como substrato para a produção de gás. O crescimento com produção de gás nos tubos de Durhan indica positividade. E na confirmação para coliformes termotolerantes é usado o Caldo EC (Escherichia coli) é um meio seletivo para os microrganismos Gram positivos devido à presença de sais biliares. É realizada a incubação em banho-maria por 24 horas a uma temperatura de 24 ºC, onde é possível observar a produção de gás, devido a fermentação da lactose em temperaturas elevadas.
Esta técnica tem a vantagem de analisar tanto amostras límpidas como turvas. O processamento das amostras pode ser feito a qualquer hora do dia. Já a desvantagem é ser um método laborioso, pois necessita de grandes quantidades de vidrarias e meio de culturas, sendo necessários repiques e longo tempo de incubação chegando a 96 horas. Para a etapa de confirmação envolvem novos cultivos aumentando as horas e os custos. Quando a seletividade do meio não é apropriada, o organismo alvo pode ser mascarado devido ao crescimento de outros microrganismos, a amostra pode possuir inibidores que afetam o crescimento do organismo de interesse
Autores relataram que técnica de múltiplos tubos foi criticada por apresentar resultados errôneos, no decorrer de diferentes etapas da metodologia. Por ser considerado método padrão, está sujeito a inúmeros tipos de interferências, como por exemplo: presenças de inibidores naturais do meio seletivo, presença de bactérias antagonistas, usam de alta temperatura de incubação e competição entre bactérias não coliformes por lactose.
TÉCNICA DE MENBRANA FILTRANTE
É um dos métodos que pode ser empregado para a quantificação de coliformes em águas. Baseia-se na filtração de volumes adequados de água, no qual as bactérias ficarão retidas na membrana filtrante, com porosidade de 0,45 μm, por serem maiores que os poros da membrana ficarão retidos em sua superfície. Para a filtração, é usado um aparelho que consta um funil de filtração com tampa, suporte de membrana e frasco coletor. Durante o procedimento, os coliformes ficam retidos na mesma, onde serão transferidas para a placa de Petri contendo o meio de cultura de acordo com a necessidade dos microrganismos, são levadas para estufa a 35 ± 5º C por 24 horas. Depois de incubadas as colônias são numeradas visualmente ou através de contadores eletrônicos.
Permite a enumeração direta do número de microrganismos com excelente exatidão e precisão, também tem a possibilidade de através de grandes volumes de amostras processadas, aumentando a sensibilidade do método. Pode ser aplicada à água bruta e tratada, também tem sido utilizado para a detecção de Toxoplasma Gondii em água, apresentando bons resultados.
Fontes: https://cetesb.sp.gov.br
www.faema.edu.br/revistas/index.php/Revista-FAEMA/article/download/339/396/
